1、富集培養(yǎng)基：?
經(jīng)典的紫色非硫細(xì)菌（紅螺菌）的富集培養(yǎng)基的配方為：NH4Cl：0.1g；?NaHCO3：0.1g；K2HPO4：0.02g；CH3COONa：0.1~0.5g；MgSO4·7H2O：0.02g；?NaCl：0.05～0.2g；?生長因子1ml，蒸餾水97ml，微量元素溶液1ml，pH為7.0。
其中，①5％NaHCO3水溶液，過濾除菌取2m1加入無菌培養(yǎng)基中。②生長因子：維生素B10.001mg、乙尼克丁酸0.1mg、對氨基苯甲酸0.1mg、生物素0.001mg，以上藥品溶于蒸餾水中，定容至10ml，然后過濾除菌。③微量元素溶液：FeCl3·6H2O?：5mg；CuS04·5H2O：0.05mg；H3BO4lmg；MnCl2·4H2O：0.05mg；ZnSO4·7H2O：1mg；Co(NO3)2·6H2O：?0.5mg。以上藥品分別溶于蒸餾水中，并定容至1000m1。
除①、②、③外，各成分溶解后100?Pa滅菌20min。然后分別加入①、②、③，如加入0.1％～0.3％的蛋白胨則能促進(jìn)該菌生長。
2、分離培養(yǎng)基：
傳統(tǒng)的紅螺科分離培養(yǎng)基的配方為：NH4Cl：0.1g；?MgCl2：0.02g；?酵母膏：0.01g；?K2HPO4：0.05g；?NaCl：?0.2g；?瓊脂2g，蒸餾水90ml。100Pa滅菌20min。
滅菌后，無菌操作加入經(jīng)過濾除菌的0.5g/5mlNaHCO3，再無菌加入過濾除菌的0.1g或0.1mlNa2S·9H2O（降低培養(yǎng)基的氧化還原值），最后再加入5ml經(jīng)過濾除菌的乙醇、戊醇或4％丙氨酸。用過濾滅菌的0.1mol/H3PO3調(diào)pH至7.0。
3、篩選富集培養(yǎng)基
? ? ? ? ? ?NH4Cl?1g/L,?NaHCO3?1g/L,?CH3COONa?3g/L,?KH2PO4?0.3g/L,?MgSO4?0.1g/L,?酵母膏0.5g/L,?微量元素母液1g,?自然pH值。擴大培養(yǎng)培養(yǎng)基以海水代替微量元素母液。1000~4000lx光照,?(30±2)℃恒溫培養(yǎng)。
參考文獻(xiàn)：固定化海洋光合細(xì)菌處理生活污水的研究*???黃寶興,李蘭生,趙亮,張微,唐迎迎????海洋湖沼通報
4、基礎(chǔ)培養(yǎng)基
NH4Cl:1g;?Na2HPO4:?0.5g;?MgSO4:?0.2g;?NaCl:?2g;?NaHCO3:?5g;?酵母膏:2g?;?乙醇2ml，用?0.1N?H3PO4調(diào)至pH7.0。
劃線培養(yǎng)基:采用固體瓊脂培養(yǎng)基，即在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加1.0%的瓊脂。
以上培養(yǎng)基初始pH值均用H3PO4調(diào)至7.0，經(jīng)121℃滅菌30分鐘，NaHCO3過濾除
菌后加入。培養(yǎng)條件:光照培養(yǎng)箱溫度控制在30℃、光照強度控制在?3000uE.m-2s-1培養(yǎng)。
光合細(xì)菌是一種兼性嫌氣細(xì)菌，需要深層培養(yǎng)或在真空干燥器內(nèi)達(dá)到嫌氣或半嫌氣狀態(tài)，一般將混合菌放入培養(yǎng)液中先富集再分離。具體方法:將混合菌裝入?10ml試管中，加入培養(yǎng)液充滿至刻度，蓋上膠塞，在光照條件下保持在30℃左右培養(yǎng)。待培養(yǎng)液出現(xiàn)紅色后，取培養(yǎng)液加1.5%的瓊脂，制成固體培養(yǎng)基，取菌液分別用無菌水以10-100000000倍稀釋，分別取lml樣本涂在平皿上，光照、30℃培養(yǎng)2d左右在平板上長出菌落。移至平板采用劃線法進(jìn)行分離，將劃好線的平板倒置，在相同條件下培養(yǎng)，反復(fù)分離純化，挑取不同特征的菌落，用斜面保存，純化分離后的菌種置于冰箱保存?zhèn)溆谩?/span>
PSB?培養(yǎng)中除碳、氮、磷等主要營養(yǎng)元素外，還需要一定量的鎂、鈣、鈉和有關(guān)的微量元素，將所需的營養(yǎng)元素按一定的比例配成適于菌體生長繁殖的培養(yǎng)基。本實驗室采用酵母膏、蛋白胨培養(yǎng)基，基本配方為:CaCl2?0.3g，MgSO4·7H2O?0.5g，酵母膏3g，蛋白胨3g，蒸餾水1000ml，pH:?6.8.?如需制固體培養(yǎng)基再加2%瓊脂。培養(yǎng)溫度：25℃～30℃最佳，光照強度：2000LX～5000LX，PH：7.5～8.5最佳。
把菌種接種到滅好菌的培養(yǎng)基中，在三角瓶中進(jìn)行二級培養(yǎng)，每天搖晃幾次。把?40L?的反應(yīng)器中加滿自來水，放入通氣管，蓋上保鮮膜一起用次氯酸殺菌消毒24小時，用硫代硫酸鈉（1L次氯酸需要150g硫代硫酸鈉）來中和。以15%的接種量接入反應(yīng)器中，用泵通氣培養(yǎng)，用分光光度計跟蹤測量菌液的密度，得到菌液的密度較高，而且反應(yīng)器還可以進(jìn)一步放大。
5、細(xì)菌生長培養(yǎng)基
NaCOOH3.0g.酵母膏3.0g，NH4CL2.0g，KH2PO4 0.5g，天然海水1000ml，高溫滅菌。
100ml具塞容量瓶中裝有50ml光合細(xì)菌培養(yǎng)基，按10%接種量接種母液（約每毫升10億個細(xì)胞）混合均勻后置于恒溫光照培養(yǎng)箱中光照厭氧培養(yǎng)，光強2500Lux，溫度30攝氏度。
6、HCH光合細(xì)菌培養(yǎng)基
滅菌條件
（1）高壓蒸汽滅菌?小件玻璃器皿、培養(yǎng)基等采用濕式高壓蒸汽滅菌。這種滅菌方式可以達(dá)到徹底的滅菌。滅菌條件：0.103?MPa，120?℃，20min。
（2）紫外滅菌?無菌操作臺采用紫外滅菌方式，用紫外燈滅菌?30min。該種方式對空氣進(jìn)行滅菌。
光合細(xì)菌的純培養(yǎng)
本課題研究所用光合細(xì)菌為?Z08，除特殊說明外，皆是由純培養(yǎng)獲得。將?50?mL?HCH?培養(yǎng)基灌裝于?250?mL?三角瓶，用封口膜將瓶口密封，以防止灰塵和雜菌進(jìn)入。灌裝好的培養(yǎng)基采用高壓蒸汽滅菌?20?min。待冷卻以后，在無菌操作臺中接種?OD660=1.0（干重?840?mg/L）的?Z08?15?mL。接種后將菌液放置在?140?rpm?的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，控制溫度?30?℃，24?h?照明，照度?500—1000?lx，培養(yǎng)?48?h?達(dá)到穩(wěn)定期。培養(yǎng)后的光合細(xì)菌保存在?4℃條件下備用。
紅色非硫光合細(xì)菌富集培養(yǎng)基的配制:?NaHCO3?1.0?g;?NH4Cl?1?g;?K2HPO4??0.2?g;CH3COONa?1.0~5.0?g;MgSO4·7H2O?0.2?g;?NaCl?0.5~2.0?g;酵母浸汁0.1?g;微量元素10?mL。
將上述成分溶于蒸餾水中,調(diào)節(jié)pH至7.0,定容1000?mL。在115℃下滅菌20?min。
光合細(xì)菌的分離與培養(yǎng)
①?液體富集培養(yǎng)基：CH3COONa?3.0?g?，CH3CH2COONa?0.3?g，NaCl?1.0?g，(NH4)2SO4?0.3?g，MgSO4·7H2O?0.5?g，K2HPO4?0.7?g，CaCl2?0.05?g，MnSO4?0.0025?g，FeSO4?0.005?g，酵母膏?0.1?g，谷氨酸?1.0?g，蒸餾水定容至?1?L，調(diào)?pH?至?7.4。
②?固體分離培養(yǎng)基：CH3COONa?3.0?g·L-1，酵母膏?3.0?g·L-1，CaCl2?0.3?g·L-1，MgSO4·7H2O?0.5g·L-1，瓊脂?20?g·L-1，調(diào)?pH7.4。
培養(yǎng)條件：取少量活性污泥樣品于裝有?120?mL?富集培養(yǎng)基的?125?mL?血清瓶中富集，置于光照培養(yǎng)箱中?30?℃培養(yǎng)，照度為?2000?1x。6~9?d?后，液體培養(yǎng)基變?yōu)榧t色，經(jīng)搖床振蕩稀釋處理后，涂布和劃線于平板固體培養(yǎng)基上，置于恒溫培養(yǎng)箱中黑暗好氧培養(yǎng)，7?d?后獲得單菌落。在平板固體培養(yǎng)基中重復(fù)劃線?3?次以上，直到在顯微鏡下觀察為純菌。
7、RCVBN擴大培養(yǎng)基
優(yōu)化培養(yǎng)實驗采用RCVBN擴大培養(yǎng)基,其組成為:CH3COONa?3.0g,?(NH4)2SO4?1.0g,?MgSO4?0.2g,?NaCl?1.0g,?KH2PO4?0.3g,?K2HPO4?0.5g,?CaCl2?0.05g,?酵母膏0.1g,?微量元素溶液1mL,?蒸餾水1000mL.
微量元素溶液為改良的Imhoff和Truper生長因子溶液,其組成為:?EDTA-2Na?2g,?FeSO4·7H2O?0.2g,?MnCl2·4H2O?0.1g,?H3BO3?0.1g,?CoCl2·6H2O?0.1g,?ZnCl2?0.1g,?Na2MoO4·2H2O?0.02g,?NiCl2·6H2O?0.02mg,?CuCl2·2H2O?0.01g,?蒸餾水1000mL。
培養(yǎng)方法
在8個CSTR光合培養(yǎng)器中進(jìn)行分批培養(yǎng),培養(yǎng)器體積為50?L。培養(yǎng)器光照根據(jù)強度不同的需要分別由三只25W,40W,60W,100W白熾燈泡組合提供,培養(yǎng)器的底部設(shè)有穿孔曝氣管,根據(jù)DO含量間歇開啟,培養(yǎng)器內(nèi)設(shè)有溫控器。
8、光合細(xì)菌參考培養(yǎng)基
無水乙酸鈉5mg，氯化銨1.0mg，磷酸氫二鉀0.2mg，MgSO4·7H2O 0.2mg， 碳酸氫鈉1.0mg，酵母浸膏0.1mg，氯化鈉1.0mg調(diào)節(jié)pH為7.1-7.2, 1.05Mpa，121攝氏度滅菌20分鐘，固體培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加15-20%瓊脂
