隨著全球水體富營(yíng)養(yǎng)化的加劇，有害藻類水華的爆發(fā)日趨頻繁，其造成的環(huán)境和經(jīng)濟(jì)問(wèn)題日益引起人們的重視。用銅制劑、除草劑等化學(xué)殺藻劑可以直接殺死藻類，但這些化學(xué)物質(zhì)的專一性差，而且容易富集在食物鏈中造成二次污染。溶藻細(xì)菌(algicidal bacteria)，作為水生生態(tài)系統(tǒng)生物種群結(jié)構(gòu)和功能的重要組成部分，對(duì)維持藻類生物量平衡具有非常重要的作用。近年來(lái)，不少國(guó)外研究者認(rèn)為：水華的突然消亡可能與溶藻細(xì)菌的感染有關(guān)。溶藻細(xì)菌作為水華防治的可能微生物，已引起越來(lái)越多的關(guān)注。多數(shù)溶藻細(xì)菌能夠分泌細(xì)胞外物質(zhì)，對(duì)宿主藻類起抑制或殺滅作用，因此通過(guò)溶藻細(xì)菌篩選高效、專一，能夠生物降解的殺藻物質(zhì)已經(jīng)成為開(kāi)發(fā)殺藻劑的一個(gè)新思路。目前國(guó)內(nèi)對(duì)溶藻細(xì)菌的研究處于起步階段，而對(duì)于細(xì)菌殺藻物質(zhì)的研究尚屬空白。鑒于此，作者根據(jù)國(guó)內(nèi)外的最新研究成果，對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)中細(xì)菌殺藻物質(zhì)的作用、種類和研究方法作一概述，并展望了溶藻細(xì)菌殺藻物質(zhì)研究和應(yīng)用前景。
在海洋和淡水水體中，由于富營(yíng)養(yǎng)化程度的加劇，藻類過(guò)量繁殖形成水華和赤潮，從而影響和改變水體的理化性質(zhì)，并且能直接或間接引起食藻動(dòng)物的大量死亡。傳統(tǒng)的治理方法如機(jī)械除藻，高頻電磁脈沖以及利用除草劑等方法，常受到成本和環(huán)境安全性問(wèn)題等諸多因素的限制。相比之下，生物控藻技術(shù)成本低、安全性好，其中溶藻細(xì)菌因其較高的除藻效力，成為防治水華和赤潮的一個(gè)新方向。溶藻細(xì)菌(algae-lysing bacteria)，作為水生生態(tài)系統(tǒng)中生物種群結(jié)構(gòu)和功能的一個(gè)重要組成部分，對(duì)水華和赤潮的控制、維持藻類生物量的平衡有非常重要的作用，它們對(duì)浮游植物的溶解作用也可能是調(diào)節(jié)水生生態(tài)系統(tǒng)中初級(jí)生產(chǎn)力的一個(gè)重要因素。水華和赤潮的突然消亡可能與溶藻細(xì)菌的感染有關(guān)。溶藻細(xì)菌作為水華和赤潮防治的生物，引起了國(guó)內(nèi)外不少學(xué)者的關(guān)注，近年來(lái)國(guó)外不斷分離出新的溶藻細(xì)菌。相對(duì)而言，國(guó)內(nèi)報(bào)道較少。近十多年來(lái)幾乎處于停滯狀態(tài)。鑒于此，作者根據(jù)國(guó)內(nèi)外的最新研究成果，從溶藻細(xì)菌的種類、作用方式及機(jī)理、篩選與分離、溶藻菌的測(cè)定、溶藻效果的評(píng)價(jià)等方面作一綜合概述。
1 溶藻細(xì)菌研究概況
所謂溶藻細(xì)菌是一類以直接或間接方式抑制藻類生長(zhǎng)，或殺死藻類、溶解藻細(xì)胞的細(xì)菌的統(tǒng)稱。溶藻細(xì)菌的研究在國(guó)外已有數(shù)十年歷史。早在1924年，Ceitler報(bào)道一種粘細(xì)菌Polyangium parasitium寄生在剛毛藻Cladophora上，使藻死亡。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中曾報(bào)道過(guò)的溶藻細(xì)菌種類不一，主要有：粘細(xì)菌、噬胞菌屬、纖維弧菌屬、節(jié)桿菌、屈撓細(xì)菌屬、蛭弧菌、黃桿菌屬、弧菌、腐生螺旋體屬、假單胞菌、鞘氨醇單胞菌屬、交替單胞菌、交替假單胞菌等。這些細(xì)菌多為革蘭氏陰性菌，它們的作用對(duì)象比較廣泛，既有藍(lán)藻，也有硅藻和甲藻。
2 溶藻細(xì)菌的作用方式及機(jī)理
研究溶藻細(xì)菌的作用方式不僅可以了解溶藻細(xì)菌的作用機(jī)制，而且可以為分離和研制高效的殺藻劑提供理論指導(dǎo)。溶藻細(xì)菌的作用方式一般分為兩種：一是直接溶藻，即直接進(jìn)攻宿主，它需要細(xì)菌與溶藻細(xì)胞直接接觸，甚至侵入藻細(xì)胞內(nèi)。Shilo M最早報(bào)道了粘細(xì)菌對(duì)藍(lán)藻的直接溶解作用，史順玉等發(fā)現(xiàn)的菌株也是直接溶藻。二是間接溶藻，即間接進(jìn)攻宿主，主要包括細(xì)菌同藻競(jìng)爭(zhēng)有限營(yíng)養(yǎng)或細(xì)菌分泌胞外物質(zhì)溶藻。其中分泌胞外物質(zhì)溶藻文獻(xiàn)報(bào)道較多，是溶藻細(xì)菌的主要作用方式。溶藻細(xì)菌可以通過(guò)釋放特異性或非特異性的胞外物質(zhì)，如蛋白質(zhì)，羥胺，抗生素，多肽，氨基酸等殺死藻細(xì)胞。報(bào)道間接溶藻作用的主要有彭超、Lee Sun-og和 Imamura等。
溶藻細(xì)菌對(duì)藻細(xì)胞作用的可能機(jī)理主要有以下5種：直接接觸溶藻、釋放殺藻物質(zhì)、細(xì)菌與藻競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物、形成菌膠膜及進(jìn)入藻細(xì)胞內(nèi)殺滅藻細(xì)胞。
2.1直接接觸溶藻
一些溶藻菌直接與藻細(xì)胞接觸，通過(guò)釋放可溶解纖維素的酶而消化藻細(xì)胞的細(xì)胞壁，進(jìn)而逐漸溶解整個(gè)藻細(xì)胞。如前所述的黏細(xì)菌對(duì)藍(lán)藻、魚(yú)腥藻、束絲藻、微囊藻以及多種顫藻的溶解作用;噬胞菌屬和腐生螺旋體屬能夠特異性地與橫裂甲藻和硅藻接觸，溶解藻細(xì)胞等均屬直接接觸溶藻。
2.2釋放殺藻物質(zhì)
細(xì)菌可以通過(guò)釋放特異性或非特異性的胞外物質(zhì)殺死藻細(xì)胞，目前報(bào)道的細(xì)菌殺藻物質(zhì)主要有蛋白質(zhì)、多肽類物質(zhì)以及抗生素。這類細(xì)菌常見(jiàn)的有弧菌、假單胞菌、黃桿菌、交替單胞菌、假交替單胞菌等。
2.3細(xì)菌與藻競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物
有些細(xì)菌可通過(guò)C、N、P、K等物質(zhì)與藻類產(chǎn)生直接或間接的聯(lián)系。如芽孢桿菌的生長(zhǎng)需要氮磷等物質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)支持，從而會(huì)使水體中的氮磷含量下降，進(jìn)而使水體無(wú)法滿足微囊藻的生長(zhǎng)需要。同時(shí)芽孢桿菌還可以微囊藻藻體作為源加以利用;另外部分真菌和放線菌也會(huì)同藻類搶奪有限的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，抑制藻類的生長(zhǎng)。
2.4形成菌膠膜
如腐敗菌、亞硝酸菌、大腸桿菌、枯草桿菌等大量出現(xiàn)時(shí)，單細(xì)胞藻類培養(yǎng)物會(huì)產(chǎn)生沉淀而顏色變黃，同時(shí)發(fā)生化學(xué)變化而發(fā)出氨臭味;另一方面，可在靜止的水面集結(jié)形成菌膠膜，有礙氣體交換和光線的透射，導(dǎo)致水環(huán)境惡化，致使藻類死亡。
2.5進(jìn)入藻細(xì)胞內(nèi)殺死藻細(xì)胞
這種溶藻方式極其少見(jiàn)，有人從水華銅綠微囊藻中分離出一種類似蛭弧菌的細(xì)菌，這種細(xì)菌能夠進(jìn)入銅綠微囊藻的細(xì)胞并使藻細(xì)胞溶解。
3 溶藻細(xì)菌篩選與分離鑒定
目前，溶藻細(xì)菌篩選主要有兩種方法：一是利用液體感染的方法進(jìn)行分離;另一種是利用固體感染的方法進(jìn)行分離。國(guó)內(nèi)外溶藻細(xì)菌一般分離自因富營(yíng)養(yǎng)化而發(fā)生水華或赤潮的湖泊及海洋，大多為革蘭氏陰性菌。由于溶藻細(xì)菌在自然水體中存在的比率比較低，故采用傳統(tǒng)的方法需要濃縮大量水樣，耗時(shí)長(zhǎng)且很難獲得理想溶藻細(xì)菌，與將來(lái)工程實(shí)際應(yīng)用相距甚遠(yuǎn)。PCR技術(shù)可以快速、靈敏、選擇性地?cái)U(kuò)增微量的DNA片段，16S rRNA序列分析可以揭示微生物種群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，利用PCR技術(shù)、細(xì)菌的16S rRNA序列分析技術(shù)，直接分析具有溶藻效果的樣品中細(xì)菌類屬和親緣關(guān)系，根據(jù)分析結(jié)果選擇合適的培養(yǎng)基和方法進(jìn)行分離培養(yǎng)，能夠克服部分溶藻細(xì)菌不易培養(yǎng)的弊端，有利于分離更多的溶藻細(xì)菌和更全面地了解水環(huán)境中的藻菌關(guān)系。實(shí)際上，國(guó)內(nèi)對(duì)溶藻細(xì)菌的研究?jī)H處于起步階段，在分子生物學(xué)水平上對(duì)溶藻細(xì)菌的研究尚未涉及。因此，尋找溶藻細(xì)菌分離源，實(shí)現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)分離篩選獲得所需菌株，對(duì)溶藻細(xì)菌的深人研究及應(yīng)用具有重要意義。
4 溶藻菌的測(cè)定及溶藻效果評(píng)價(jià)
4.1 溶藻菌的測(cè)定
常規(guī)用于微生物檢驗(yàn)的生理生化方法由于較難檢測(cè)與判斷細(xì)菌在空間與時(shí)間上的分布，又由于溶藻細(xì)菌在自然水體中含量較低，故該類方法不適宜對(duì)環(huán)境中溶藻菌進(jìn)行測(cè)定。目前發(fā)展的溶藻菌在天然水環(huán)境中時(shí)間與空間分布的檢驗(yàn)方法主要集中在分子生物學(xué)技術(shù)方面。
4.1.1實(shí)時(shí)定量PCR法
采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)可定量檢測(cè)目標(biāo)溶藻菌如銅綠假單胞菌、芽孢桿菌、交替假單胞菌等的含量與分布。其原理為運(yùn)用該細(xì)菌屬的特異性引物，快速檢測(cè)出目標(biāo)細(xì)菌DNA模板在總DNA模板中的比例，進(jìn)而推算出目標(biāo)細(xì)菌在樣本中的豐度。
4.1.2 PCR-變性梯度凝膠電泳法
采用PCR-變性梯度凝膠電泳技術(shù)(PCR-DGGE)測(cè)定時(shí)，不用對(duì)細(xì)菌進(jìn)行富集培養(yǎng)，可根據(jù)條帶的多少以及明亮程度來(lái)判斷細(xì)菌的多樣性以及優(yōu)勢(shì)菌群，能夠較為準(zhǔn)確客觀地反映實(shí)際環(huán)境樣本中的細(xì)菌時(shí)空分布情況。
4.1.3熒光原位雜交法
熒光原位雜交法(FISH)快速便捷，不僅可以定性，而且可以對(duì)環(huán)境中的細(xì)菌進(jìn)行直接計(jì)數(shù)，為研究細(xì)菌類群的空間分布和數(shù)量分布提供了有效的檢測(cè)工具。但該法要求環(huán)境樣品中的待測(cè)細(xì)菌有較高的濃度，并且對(duì)于罕見(jiàn)的核酸序列，熒光探針造價(jià)較高。
4.2溶藻效果評(píng)價(jià)
目前篩選溶藻細(xì)菌，對(duì)溶藻細(xì)菌溶藻效果的評(píng)價(jià)主要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行：藻液顏色變化;顯微鏡觀察藻細(xì)胞的形態(tài)特征變化;藻細(xì)胞生物量測(cè)定;還有通過(guò)測(cè)定光合效能、丙二醛含量等方法判定細(xì)菌溶藻效果。若藻液黃化、藻細(xì)胞發(fā)生破碎、葉綠素含量下降、光合效能降低以及丙二醛含量增高等，均說(shuō)明供試細(xì)菌具有溶藻能力。
5 以菌治藻需考慮的問(wèn)題
利用溶藻細(xì)菌治理水華，可使水環(huán)境保持生態(tài)平衡，從而達(dá)到防止赤潮的目的。但在以菌治藻的工程實(shí)施之前還有大量的工作要開(kāi)展：
5.1 殺藻作用與細(xì)菌的種屬特異性的關(guān)系。雖然細(xì)菌殺藻的現(xiàn)象普遍存在于淡水與海水中，但有時(shí)又具有明顯的種屬特異性。深見(jiàn)公雄等研究細(xì)菌的抑藻作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，黃桿菌Flavobactereum sp.對(duì)裸甲藻Gymnodinium nagasakiense具有強(qiáng)烈的抑制和殺滅作用，而對(duì)Chattonella;Heterosigina akashiwa和骨條藻Skeletonima costatum均無(wú)效。這表明該細(xì)菌對(duì)G.nagasakiense的殺滅作用是專一的。這種情況雖然沒(méi)有更多的報(bào)道，但無(wú)疑菌種選擇對(duì)防治效果而言是關(guān)鍵所在。對(duì)不同藻類引起的赤潮要采用不同的細(xì)菌，最合適的菌株應(yīng)該是抑藻強(qiáng)烈而選擇性高的種類，并且對(duì)魚(yú)類和其他動(dòng)物無(wú)害。
5.2 關(guān)于投放細(xì)菌的量即細(xì)菌密度。細(xì)菌抑藻有一定的閾值密度，低于這個(gè)密度抑藻作用就不會(huì)發(fā)生。如Flavobactereum sp.抑制Gymnodinium nagasakiense，當(dāng)細(xì)菌密度大于100 000時(shí)才會(huì)有明顯殺藻作用。即時(shí)同樣的細(xì)菌，對(duì)不同藻類也有不同的閾值密度。如Shigeki Sawyama等研究細(xì)菌殺藻作用，發(fā)現(xiàn)一種革蘭氏陰性菌NT4可抑制萊茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii的接合反應(yīng)。這種細(xì)菌也可抑制有毒甲藻Alexandrium catenella的休眠接合子結(jié)構(gòu)，但需要的濃度是抑制萊茵衣藻的128倍。所以細(xì)菌的量要足夠大才可產(chǎn)生預(yù)期的殺藻效果。
5.3 細(xì)菌投放的時(shí)間。在赤潮發(fā)生和演替的過(guò)程中，自然菌群的組成也發(fā)生著巨大變化，對(duì)赤潮藻也有著不同的作用。如長(zhǎng)崎裸甲藻Gymnodinium nagasakiense赤潮的開(kāi)始階段，菌群對(duì)其生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，而赤潮消亡時(shí)期，則表現(xiàn)為抑制作用。若在赤潮已形成后的早期投放細(xì)菌，勢(shì)必投入大量抑藻細(xì)菌才可改變菌群組成以達(dá)到抑藻目的;若在赤潮后期投放細(xì)菌，則不需太多的量，也可比較有效地促進(jìn)赤潮的消亡。最恰當(dāng)?shù)姆椒ㄊ嵌ㄆ跈z測(cè)海洋菌群的組成，如果發(fā)現(xiàn)其多樣性下降(這往往是赤潮的先兆)，立即投放多種抑藻細(xì)菌，以維持海洋生態(tài)環(huán)境的生態(tài)平衡，防患于未然。
5.4 海水影響程度。諸多研究表明，細(xì)菌的殺藻作用與水環(huán)境營(yíng)養(yǎng)濃度有密切關(guān)系。有些細(xì)菌的殺藻作用是通過(guò)與藻類競(jìng)爭(zhēng)有限的營(yíng)養(yǎng)物而使藻細(xì)胞餓死。這樣的水體中，營(yíng)養(yǎng)物濃度不會(huì)過(guò)高。而有些細(xì)菌的殺藻作用只有在營(yíng)養(yǎng)豐富的基質(zhì)中才會(huì)發(fā)生，如粘細(xì)菌的赤潮(這是較為常見(jiàn)的)，就不能不考慮那里的營(yíng)養(yǎng)程度是否足以為粘細(xì)菌殺藻提供可能，如果營(yíng)養(yǎng)很貧乏，就不能采用粘細(xì)菌來(lái)防治這樣的赤潮。
6 細(xì)菌防治的可能途徑
6.1 必須分離出對(duì)水華及赤潮藻類有特殊抑制效果的菌株。在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)其抑藻效果，測(cè)量其最低抑藻濃度等有關(guān)指標(biāo)，對(duì)每種細(xì)菌建立一個(gè)檔案，保存起來(lái)以備使用。
6.2 細(xì)菌或細(xì)菌抑藻因子的大量生產(chǎn)?？刹捎冒l(fā)酵罐大量繁殖抑藻細(xì)菌;也可采用基因工程手段，將細(xì)菌中產(chǎn)生抑藻因子的基因引入工程菌如大腸桿菌進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。
6.3 細(xì)菌的投放。大量生產(chǎn)的抑藻菌或抑藻物質(zhì)制成水劑或片劑，隨時(shí)可根據(jù)需要投放于水體中。若赤潮已發(fā)生，則投入抑藻物質(zhì);若赤潮尚未發(fā)生，則投入抑藻菌以維持海洋菌群的平衡。
水華和赤潮的爆發(fā)是多種因素綜合作用的結(jié)果，經(jīng)驗(yàn)表明，僅靠一種治理方案往往難以取得理想效果。以菌治藻作為水華和赤潮生物防治的一個(gè)新對(duì)策，尚需其他治理方案的配合，而且還有許多方面值得考慮和進(jìn)一步探索。只有在生態(tài)系統(tǒng)良性循環(huán)的基礎(chǔ)上以菌治藻，才是溶藻細(xì)菌防治水華和赤潮的最佳選擇。
