微藻營養(yǎng)豐富，是魚、蝦、貝等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物人工育苗的基礎(chǔ)。特別是海洋微藻，由于富含EPA和DHA，在許多方面受到人們的青睞。在微藻的培養(yǎng)和應(yīng)用中，保種技術(shù)十分重要，它是微藻培養(yǎng)和進(jìn)一步應(yīng)用的基礎(chǔ)和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。由于藻種極易受污染，分離培養(yǎng)方法比較復(fù)雜而且耗時(shí)較長，因此，在微藻保種工作中要盡量減少接種次數(shù)，避免藻種被雜藻、細(xì)菌或原生動(dòng)物污染，既能達(dá)到長期貯藏種質(zhì)的目的，又能維持藻種的活性，是微藻科研工作者努力的方向之一。本文就微藻保存的幾種常用方法介紹如下。

一、繼代法保存

繼代保存法是目前普遍采用的方法，使用于一切藻種的保存。通常在常溫或常低溫進(jìn)行。常溫一般指15℃～25℃，常低溫一般指0℃～15℃，藻種可接種在固體、液體或雙相培養(yǎng)基中。接種后應(yīng)首先放在適宜的光照條件下培養(yǎng)，待藻細(xì)胞生長繁殖達(dá)到較高密度，可見明顯的條狀或塊狀的藻細(xì)胞群時(shí)，再移置低溫、弱光的條件下保藏。保藏半年到1年后必須進(jìn)行轉(zhuǎn)接。此方法簡單易行，但是保存時(shí)間短，而且繼代頻繁，容易發(fā)生污染和變異。

二、固定化保存法

固定化細(xì)胞（1mmobilized cells）是指將游離細(xì)胞包埋在多糖或多聚化合物制成的網(wǎng)狀支持物中，固定載體束縛藻種，影響其代謝過程，從而抑制細(xì)胞的生長和分裂。固定化微生物技術(shù)是在20世紀(jì)60年代固定化酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，1978年以來，固定化技術(shù)就被用來作為延長光合細(xì)胞壽命的一種重要手段。但微藻存活時(shí)間從1個(gè)月到幾年不等。張繼紅將三角褐脂藻固定在褐藻酸鈣凝膠中，可保存3～5年；Tamponnet等報(bào)道了固定化纖細(xì)裸藻存活2年；矮小海鏈藻（Thalassiosira pseudonana）和賀氏鈣板金藻 （Emiliana hux liyi）僅能保存3個(gè)月。近來孟妍等人采用褐藻膠包埋技術(shù)與干燥脫水技術(shù)相結(jié)合將綠色巴夫藻常溫保存，保存時(shí)間可達(dá)6個(gè)月存活率高達(dá)77.6%。

固定化保種技術(shù)對(duì)多數(shù)微藻是適用的，該法可以在常低溫下實(shí)現(xiàn)對(duì)藻類的中期保存，培養(yǎng)保存時(shí)間較長，活化復(fù)蘇快，技術(shù)設(shè)備簡單，細(xì)胞外滲少，而且可用于次生代謝物質(zhì)的生產(chǎn)。在一般的微藻實(shí)驗(yàn)室內(nèi)都能進(jìn)行。但固定化程序較復(fù)雜，大多數(shù)微藻在培養(yǎng)后期常會(huì)從膠珠中溢出。而且，現(xiàn)有的資料表明，某種固定化方法只適用一定種類的微藻，對(duì)于其他種類的微藻會(huì)有不同的反應(yīng)，原因復(fù)雜，還需要做更深入、廣泛的研究。這就給固定化保種技術(shù)的推廣帶來了一定的困難。

三、超低溫保種技術(shù)

所謂超低溫保存區(qū)別于其他低溫概念的冰箱溫度（4℃～～40℃）和干冰溫度（～79℃），是指在液氮低溫（～196℃）下保存。此時(shí)生物體的物質(zhì)代謝和生長活動(dòng)幾乎完全停止。可是它們?nèi)蕴幱诳赡娴某苫顮顟B(tài)。早在20世紀(jì)70年代，英國的Morris等就對(duì)海產(chǎn)單胞藻進(jìn)行了超低溫保存研究，取得了在～196℃下保存1年，存活率100%的結(jié)果。目前普遍采用兩步冷凍法，即慢速降溫進(jìn)行冷適應(yīng)，然后投入液氮中保存。王起華等用兩步冷凍法研究了3種餌料金藻，其存活率均在30%左右。

超低溫保存法具有保持種質(zhì)遺傳穩(wěn)定性、對(duì)藻種進(jìn)行優(yōu)勝劣汰、便于長期保存、能最大限度地減少污染等方面的優(yōu)點(diǎn)，還能省去藻種的活力監(jiān)測和繁殖更新。但微藻的種類很多，生理狀態(tài)各異，適宜的保存條件各不相同，找出不同微藻的超低溫保種方法困難，而且不同的細(xì)胞要求不同類型、不同濃度的抗凍劑， 至今還沒有找出1種對(duì)所有種類都適用的保護(hù)劑。但隨著研究的深入，在探明生物細(xì)胞凍害和抗凍機(jī)理的基礎(chǔ)上，超低溫保存微藻藻種的應(yīng)用前景將會(huì)是十分光明的。

四、濃縮低溫保存技術(shù)

濃縮低溫保存法是將藻液高密度培養(yǎng)后，采用物理、化學(xué)的方法濃縮1000倍左右，再低溫保存。國外自80年代末開始就有對(duì)海洋經(jīng)濟(jì)微藻的濃縮方法和低溫保存方法進(jìn)行研究，取得了不少的研究成果，其中美國、英國和日本已有相應(yīng)的產(chǎn)品（微藻濃縮細(xì)胞或稱“藻膏”）問世。蔣霞敏等將小球藻和球等鞭金藻301（1sochrysis galbana Park）濃縮后，在5℃～7℃的冰箱中保存1～3個(gè)月后恢復(fù)生長獲得好于常溫的效果。孫建華、王如才（1993）對(duì)小新月菱形藻（Nitzschia closterium）、球等鞭金藻的濃縮和保存方法進(jìn)行了研究，濃縮藻液在1℃～4℃的低溫下加保護(hù)劑SAMs保存3個(gè)月，復(fù)蘇后效果良好。
濃縮低溫保存多用于海洋微藻。微藻濃縮液的生產(chǎn)，可以使海洋微藻的生產(chǎn)與使用保留一定的時(shí)間差。但相對(duì)保存時(shí)間較短，海洋微藻的抗逆原理還有待作更多的研究和探討。

五、冷凍真空干燥保存法

冷凍真空干燥保存法是在極低溫度下（～70℃左右）快速冷凍，然后在極低溫度下真空干燥，使藻種的新陳代謝活動(dòng)處于高度靜止?fàn)顟B(tài)。19世紀(jì)末Fkral與Mudd創(chuàng)立的冷凍真空干燥法是迄今公認(rèn)最佳的藻種保存法，嚴(yán)珍等選擇脫脂牛奶作為保護(hù)劑，將藻液放入安瓿管中，冷凍、干燥并抽真空，火焰熔封。在低溫避光處保存，預(yù)計(jì)最大保存年限為18年。冷凍干燥保存法優(yōu)點(diǎn)是微藻復(fù)蘇效果好，保藏期內(nèi)可避免其他雜菌污染，便于攜帶運(yùn)輸，易實(shí)現(xiàn)商品化生產(chǎn)；其缺點(diǎn)是操作繁瑣、對(duì)設(shè)備要求高等；應(yīng)用前景十分光明。

六、低溫甘油生理鹽水法

低溫甘油生理鹽水法是對(duì)甘油原液保存法的改進(jìn)。加入生理鹽水適當(dāng)降低了甘油的高滲作用，更有利于藻種的保存。在藻液中人一定的甘油作保護(hù)劑，同時(shí)加入一定的生理鹽水，混勻后直接放置在～20℃±0.5℃冰箱放置保存。保存時(shí)間長，一般3年左右。
綜上所述，單細(xì)胞藻類的保種技術(shù)尚沒有發(fā)展成為一項(xiàng)成熟穩(wěn)定的技術(shù)，許多問題還有待于我們?nèi)ヌ剿?，開展微藻保種方面的研究工作，不但會(huì)填補(bǔ)微藻保種理論研究上的空白，還會(huì)在生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)揮應(yīng)有的作用。

關(guān)鍵詞:單細(xì)胞藻種,固體培養(yǎng)基,保種

氮源單細(xì)胞(Unicelluler)藻種的保藏一直是制約工廠化育苗生產(chǎn)中單胞藻正常供應(yīng)和長期保存的重要因素。通常采用液體保藏方法，周期短、易污染、保藏條件：難以控制，容易造成藻種保種失敗。

采用固體培養(yǎng)基保藏，可以通過營養(yǎng)成分的緩釋作用，在適宜的條件下延長保藏期2~3年。

但需解決一些關(guān)鍵問題，一是藻種的提純技術(shù)，二是選擇合適的固體培養(yǎng)基營養(yǎng)成分，否則接種保藏難以取得良好的效果。國內(nèi)有關(guān)固體培養(yǎng)基保藏藻種的實(shí)用技術(shù)詳細(xì)報(bào)道不是很多，大部分僅作粗略介紹，有些在實(shí)際應(yīng)用中效果不理想，如金藻門(Chrysophyta)的球等鞭金藻3010、3011、湛江叉鞭藻、顆石藻以及硅藻門的牟氏角毛藻等，按照資料中介紹以硝酸鈉為氮源、2％瓊脂制成的培養(yǎng)基來培養(yǎng)保存藻種往往失敗。而改用以尿素為氮源，5~6‰瓊脂制成的培養(yǎng)基保種，藻種生長正常并且易提純。

其它綠藻門(Chlorophyta)、硅藻門(Bacillariophyta)、和黃藻門(Xanthophyta)等海洋單細(xì)胞藻種固體培養(yǎng)基保藏方法也可以用此方法?，F(xiàn)介紹如下：

1、材料與方法
1.1 儀器設(shè)備：超凈工作臺(tái)、Nikon攝影顯微鏡、生化培養(yǎng)箱、電熱蒸汽壓力消毒器、電子天平、電熱爐、無菌封口膜、三角錐形瓶、移液管、酒精燈、接種針等。
1.2?試劑藥品：純化瓊脂粉、尿素、硝酸鈉、磷酸二氫鉀、魯歌氏溶液、檸檬酸鐵、硅酸鈉、碳酸氫鈉、山梨酸鉀、EDTA-Na、VB1、VB12等。
1.3?藻類材料：球等鞭金藻(Isochrysis galbana OA-3011、OA-3010)、湛江等鞭金藻 (Isochrysis zhangjiangensis?Hu&Liu)、Coccolithus藻、綠色巴夫藻(Pavlova viridis?)、牟氏角毛藻(Chaetoceros meülleri?Lemmermann)、異膠藻(Heterogioea sp．)、小球藻Chlorella sp.)、中肋骨條藻(?Skeletonema costatum?Greville)。

1.4?方法：

1.4.1 藻種液的制備：在固體培養(yǎng)基接種前一周將上述單細(xì)胞藻種分別無菌接種，目的是確保固體培養(yǎng)基接種時(shí)藻群處于指數(shù)生長期。

1.4.2 固體培養(yǎng)基的制備：固體培養(yǎng)基制備按照下述(1.4.3)培養(yǎng)基營養(yǎng)成分配制培養(yǎng)液，營養(yǎng)成分的加入順序依次為N、P、Fe、Si、VB、NaHC03、山梨酸鉀、EDTA-Na等。每加入一種營養(yǎng)物質(zhì)，?都要攪拌均勻，再加入第二種。最后加入瓊脂，營養(yǎng)液配好后置于可調(diào)溫電熱爐上加熱微融化。趁熱分裝于100ml的三角錐形瓶中，分裝量每瓶約30-40ml左右，三角錐形瓶口采用無菌培養(yǎng)容器封口膜封口。

1.4.3 固體培養(yǎng)基配方：金藻門、綠藻門、硅藻門、黃藻門配方如下：

1.4.4 固體培養(yǎng)基滅菌將分裝好的固體培養(yǎng)基放入高壓滅菌器，壓力15磅，溫度121℃，時(shí)間三十分鐘。

1.4.5 接種與培養(yǎng)在超凈工作臺(tái)上或酒精燈下，將上述藻液接種至已冷卻固體培養(yǎng)基中，一般采用接種環(huán)刺穿培養(yǎng)基表面劃“之”或“井”字線法，接種完畢的固體培養(yǎng)基置于溫度20-25℃、自然光照(3000-5000lux左右，避免直射光)的環(huán)境條件中培養(yǎng)，約十天，即可發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基上有藻落生長。

1.4.6低溫保藏將藻落生長良好的固體培養(yǎng)基置于10℃的低溫培養(yǎng)箱中，自然光照即可。在此條件下，藻種可以保藏2-3年左右。

2．結(jié)果與分析

2.1結(jié)果：在藻種接種后一周，部分藻種的固體培養(yǎng)基內(nèi)藻細(xì)胞逐漸繁殖起來，一個(gè)月后，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)一中綠藻門的小球藻，黃藻門的異膠藻、硅藻門的中肋骨條藻、牟氏角毛藻、金藻門的幾種金藻，藻群群落都能正常生長。試驗(yàn)二中除金藻門及牟氏角毛藻外，其他藻都能正常生長。

2.2討論
(1)試驗(yàn)一與試驗(yàn)二固體培養(yǎng)基中營養(yǎng)成份所不同的足提供氮源的營養(yǎng)鹽不同。試驗(yàn)一為尿素，試驗(yàn)二為硝酸鈉，可見不同的氮源在單胞藻保種過程中起著不同的作用。分析原因，是因?yàn)榍虻缺?010、301l、湛江叉鞭藻、牟氏角毛藻等單細(xì)胞藻具有尿素酶，能分解尿素作氮源，而利用硝酸鈉作氮源，需要將硝態(tài)氮還原成銨態(tài)氮，這幾種藻含有的異養(yǎng)菌較少，又由于處于無菌的環(huán)境中，所以藻種在試驗(yàn)一中能正常生長，而在試驗(yàn)二中不能正常生長。

(2)單胞藻的提純：采用固體培養(yǎng)基接種保藏方法，常發(fā)現(xiàn)雜藻藻落存在，可采用接種環(huán)將所需藻種重新接種至預(yù)備固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)保藏，這樣反復(fù)幾次，使藻種得到提純。

(3)瓊脂：在添加瓊脂時(shí)不能機(jī)械的照搬資料中介紹的2%用量，要根據(jù)瓊脂的質(zhì)量靈活使用，可預(yù)先多做幾組培養(yǎng)基試驗(yàn)了解瓊脂的特性，不同質(zhì)量的瓊脂所添加的量是不同的，培養(yǎng)基太硬，影響營養(yǎng)鹽的緩釋，水分易失去，不利藻群的生長，培養(yǎng)基太軟又起不到固體低溫保存延長保種時(shí)間的目的?？傊?，要具體問題具體分析，有時(shí)可根據(jù)保種的需要制成半固體狀態(tài)的培養(yǎng)基，一方面營養(yǎng)鹽緩慢釋放，另一方面，水分含量較高，培養(yǎng)基不易干燥，有利于藻種的保存。

(4)EDTA-Na：EDTA-Na能絡(luò)和海水中的重金屬離子但同時(shí)也將單胞藻生長繁殖需要的微量元素絡(luò)和掉了，用量要小，一般不能超過5mg/L。在保種時(shí)，固體培養(yǎng)基不使用EDTA-Na藻群也能正常生長。