隨著全球水體富營養(yǎng)化的加劇，有害藻類水華的爆發(fā)日趨頻繁，其造成的環(huán)境和經(jīng)濟問題日益引起人們的重視。用銅制劑、除草劑等化學(xué)殺藻劑可以直接殺死藻類，但這些化學(xué)物質(zhì)的專一性差，而且容易富集在食物鏈中造成二次污染。溶藻細菌(algicidal bacteria)，作為水生生態(tài)系統(tǒng)生物種群結(jié)構(gòu)和功能的重要組成部分，對維持藻類生物量平衡具有非常重要的作用。近年來，不少國外研究者認為：水華的突然消亡可能與溶藻細菌的感染有關(guān)。溶藻細菌作為水華防治的可能微生物，已引起越來越多的關(guān)注。多數(shù)溶藻細菌能夠分泌細胞外物質(zhì)，對宿主藻類起抑制或殺滅作用，因此通過溶藻細菌篩選高效、專一，能夠生物降解的殺藻物質(zhì)已經(jīng)成為開發(fā)殺藻劑的一個新思路。目前國內(nèi)對溶藻細菌的研究處于起步階段，而對于細菌殺藻物質(zhì)的研究尚屬空白。鑒于此，作者根據(jù)國內(nèi)外的最新研究成果，對水生生態(tài)系統(tǒng)中細菌殺藻物質(zhì)的作用、種類和研究方法作一概述，并展望了溶藻細菌殺藻物質(zhì)研究和應(yīng)用前景。
在海洋和淡水水體中，由于富營養(yǎng)化程度的加劇，藻類過量繁殖形成水華和赤潮，從而影響和改變水體的理化性質(zhì)，并且能直接或間接引起食藻動物的大量死亡。傳統(tǒng)的治理方法如機械除藻，高頻電磁脈沖以及利用除草劑等方法，常受到成本和環(huán)境安全性問題等諸多因素的限制。相比之下，生物控藻技術(shù)成本低、安全性好，其中溶藻細菌因其較高的除藻效力，成為防治水華和赤潮的一個新方向。溶藻細菌(algae-lysing bacteria)，作為水生生態(tài)系統(tǒng)中生物種群結(jié)構(gòu)和功能的一個重要組成部分，對水華和赤潮的控制、維持藻類生物量的平衡有非常重要的作用，它們對浮游植物的溶解作用也可能是調(diào)節(jié)水生生態(tài)系統(tǒng)中初級生產(chǎn)力的一個重要因素。水華和赤潮的突然消亡可能與溶藻細菌的感染有關(guān)。溶藻細菌作為水華和赤潮防治的生物，引起了國內(nèi)外不少學(xué)者的關(guān)注，近年來國外不斷分離出新的溶藻細菌。相對而言，國內(nèi)報道較少。近十多年來幾乎處于停滯狀態(tài)。鑒于此，作者根據(jù)國內(nèi)外的最新研究成果，從溶藻細菌的種類、作用方式及機理、篩選與分離、溶藻菌的測定、溶藻效果的評價等方面作一綜合概述。
1 溶藻細菌研究概況
所謂溶藻細菌是一類以直接或間接方式抑制藻類生長，或殺死藻類、溶解藻細胞的細菌的統(tǒng)稱。溶藻細菌的研究在國外已有數(shù)十年歷史。早在1924年，Ceitler報道一種粘細菌Polyangium parasitium寄生在剛毛藻Cladophora上，使藻死亡。國內(nèi)外文獻中曾報道過的溶藻細菌種類不一，主要有：粘細菌、噬胞菌屬、纖維弧菌屬、節(jié)桿菌、屈撓細菌屬、蛭弧菌、黃桿菌屬、弧菌、腐生螺旋體屬、假單胞菌、鞘氨醇單胞菌屬、交替單胞菌、交替假單胞菌等。這些細菌多為革蘭氏陰性菌，它們的作用對象比較廣泛，既有藍藻，也有硅藻和甲藻。
2 溶藻細菌的作用方式及機理
研究溶藻細菌的作用方式不僅可以了解溶藻細菌的作用機制，而且可以為分離和研制高效的殺藻劑提供理論指導(dǎo)。溶藻細菌的作用方式一般分為兩種：一是直接溶藻，即直接進攻宿主，它需要細菌與溶藻細胞直接接觸，甚至侵入藻細胞內(nèi)。Shilo M最早報道了粘細菌對藍藻的直接溶解作用，史順玉等發(fā)現(xiàn)的菌株也是直接溶藻。二是間接溶藻，即間接進攻宿主，主要包括細菌同藻競爭有限營養(yǎng)或細菌分泌胞外物質(zhì)溶藻。其中分泌胞外物質(zhì)溶藻文獻報道較多，是溶藻細菌的主要作用方式。溶藻細菌可以通過釋放特異性或非特異性的胞外物質(zhì)，如蛋白質(zhì)，羥胺，抗生素，多肽，氨基酸等殺死藻細胞。報道間接溶藻作用的主要有彭超、Lee Sun-og和 Imamura等。
溶藻細菌對藻細胞作用的可能機理主要有以下5種：直接接觸溶藻、釋放殺藻物質(zhì)、細菌與藻競爭營養(yǎng)物、形成菌膠膜及進入藻細胞內(nèi)殺滅藻細胞。
2.1直接接觸溶藻
一些溶藻菌直接與藻細胞接觸，通過釋放可溶解纖維素的酶而消化藻細胞的細胞壁，進而逐漸溶解整個藻細胞。如前所述的黏細菌對藍藻、魚腥藻、束絲藻、微囊藻以及多種顫藻的溶解作用;噬胞菌屬和腐生螺旋體屬能夠特異性地與橫裂甲藻和硅藻接觸，溶解藻細胞等均屬直接接觸溶藻。
2.2釋放殺藻物質(zhì)
細菌可以通過釋放特異性或非特異性的胞外物質(zhì)殺死藻細胞，目前報道的細菌殺藻物質(zhì)主要有蛋白質(zhì)、多肽類物質(zhì)以及抗生素。這類細菌常見的有弧菌、假單胞菌、黃桿菌、交替單胞菌、假交替單胞菌等。
2.3細菌與藻競爭營養(yǎng)物
有些細菌可通過C、N、P、K等物質(zhì)與藻類產(chǎn)生直接或間接的聯(lián)系。如芽孢桿菌的生長需要氮磷等物質(zhì)的營養(yǎng)支持，從而會使水體中的氮磷含量下降，進而使水體無法滿足微囊藻的生長需要。同時芽孢桿菌還可以微囊藻藻體作為源加以利用;另外部分真菌和放線菌也會同藻類搶奪有限的營養(yǎng)物質(zhì)，抑制藻類的生長。
2.4形成菌膠膜
如腐敗菌、亞硝酸菌、大腸桿菌、枯草桿菌等大量出現(xiàn)時，單細胞藻類培養(yǎng)物會產(chǎn)生沉淀而顏色變黃，同時發(fā)生化學(xué)變化而發(fā)出氨臭味;另一方面，可在靜止的水面集結(jié)形成菌膠膜，有礙氣體交換和光線的透射，導(dǎo)致水環(huán)境惡化，致使藻類死亡。
2.5進入藻細胞內(nèi)殺死藻細胞
這種溶藻方式極其少見，有人從水華銅綠微囊藻中分離出一種類似蛭弧菌的細菌，這種細菌能夠進入銅綠微囊藻的細胞并使藻細胞溶解。
3 溶藻細菌篩選與分離鑒定
目前，溶藻細菌篩選主要有兩種方法：一是利用液體感染的方法進行分離;另一種是利用固體感染的方法進行分離。國內(nèi)外溶藻細菌一般分離自因富營養(yǎng)化而發(fā)生水華或赤潮的湖泊及海洋，大多為革蘭氏陰性菌。由于溶藻細菌在自然水體中存在的比率比較低，故采用傳統(tǒng)的方法需要濃縮大量水樣，耗時長且很難獲得理想溶藻細菌，與將來工程實際應(yīng)用相距甚遠。PCR技術(shù)可以快速、靈敏、選擇性地擴增微量的DNA片段，16S rRNA序列分析可以揭示微生物種群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，利用PCR技術(shù)、細菌的16S rRNA序列分析技術(shù)，直接分析具有溶藻效果的樣品中細菌類屬和親緣關(guān)系，根據(jù)分析結(jié)果選擇合適的培養(yǎng)基和方法進行分離培養(yǎng)，能夠克服部分溶藻細菌不易培養(yǎng)的弊端，有利于分離更多的溶藻細菌和更全面地了解水環(huán)境中的藻菌關(guān)系。實際上，國內(nèi)對溶藻細菌的研究僅處于起步階段，在分子生物學(xué)水平上對溶藻細菌的研究尚未涉及。因此，尋找溶藻細菌分離源，實現(xiàn)短時間內(nèi)分離篩選獲得所需菌株，對溶藻細菌的深人研究及應(yīng)用具有重要意義。
4 溶藻菌的測定及溶藻效果評價
4.1 溶藻菌的測定
常規(guī)用于微生物檢驗的生理生化方法由于較難檢測與判斷細菌在空間與時間上的分布，又由于溶藻細菌在自然水體中含量較低，故該類方法不適宜對環(huán)境中溶藻菌進行測定。目前發(fā)展的溶藻菌在天然水環(huán)境中時間與空間分布的檢驗方法主要集中在分子生物學(xué)技術(shù)方面。
4.1.1實時定量PCR法
采用實時定量PCR技術(shù)可定量檢測目標(biāo)溶藻菌如銅綠假單胞菌、芽孢桿菌、交替假單胞菌等的含量與分布。其原理為運用該細菌屬的特異性引物，快速檢測出目標(biāo)細菌DNA模板在總DNA模板中的比例，進而推算出目標(biāo)細菌在樣本中的豐度。
4.1.2 PCR-變性梯度凝膠電泳法
采用PCR-變性梯度凝膠電泳技術(shù)(PCR-DGGE)測定時，不用對細菌進行富集培養(yǎng)，可根據(jù)條帶的多少以及明亮程度來判斷細菌的多樣性以及優(yōu)勢菌群，能夠較為準(zhǔn)確客觀地反映實際環(huán)境樣本中的細菌時空分布情況。
4.1.3熒光原位雜交法
熒光原位雜交法(FISH)快速便捷，不僅可以定性，而且可以對環(huán)境中的細菌進行直接計數(shù)，為研究細菌類群的空間分布和數(shù)量分布提供了有效的檢測工具。但該法要求環(huán)境樣品中的待測細菌有較高的濃度，并且對于罕見的核酸序列，熒光探針造價較高。
4.2溶藻效果評價
目前篩選溶藻細菌，對溶藻細菌溶藻效果的評價主要從以下幾個方面進行：藻液顏色變化;顯微鏡觀察藻細胞的形態(tài)特征變化;藻細胞生物量測定;還有通過測定光合效能、丙二醛含量等方法判定細菌溶藻效果。若藻液黃化、藻細胞發(fā)生破碎、葉綠素含量下降、光合效能降低以及丙二醛含量增高等，均說明供試細菌具有溶藻能力。
5 以菌治藻需考慮的問題
利用溶藻細菌治理水華，可使水環(huán)境保持生態(tài)平衡，從而達到防止赤潮的目的。但在以菌治藻的工程實施之前還有大量的工作要開展：
5.1 殺藻作用與細菌的種屬特異性的關(guān)系。雖然細菌殺藻的現(xiàn)象普遍存在于淡水與海水中，但有時又具有明顯的種屬特異性。深見公雄等研究細菌的抑藻作用時發(fā)現(xiàn)，黃桿菌Flavobactereum sp.對裸甲藻Gymnodinium nagasakiense具有強烈的抑制和殺滅作用，而對Chattonella;Heterosigina akashiwa和骨條藻Skeletonima costatum均無效。這表明該細菌對G.nagasakiense的殺滅作用是專一的。這種情況雖然沒有更多的報道，但無疑菌種選擇對防治效果而言是關(guān)鍵所在。對不同藻類引起的赤潮要采用不同的細菌，最合適的菌株應(yīng)該是抑藻強烈而選擇性高的種類，并且對魚類和其他動物無害。
5.2 關(guān)于投放細菌的量即細菌密度。細菌抑藻有一定的閾值密度，低于這個密度抑藻作用就不會發(fā)生。如Flavobactereum sp.抑制Gymnodinium nagasakiense，當(dāng)細菌密度大于100 000時才會有明顯殺藻作用。即時同樣的細菌，對不同藻類也有不同的閾值密度。如Shigeki Sawyama等研究細菌殺藻作用，發(fā)現(xiàn)一種革蘭氏陰性菌NT4可抑制萊茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii的接合反應(yīng)。這種細菌也可抑制有毒甲藻Alexandrium catenella的休眠接合子結(jié)構(gòu)，但需要的濃度是抑制萊茵衣藻的128倍。所以細菌的量要足夠大才可產(chǎn)生預(yù)期的殺藻效果。
5.3 細菌投放的時間。在赤潮發(fā)生和演替的過程中，自然菌群的組成也發(fā)生著巨大變化，對赤潮藻也有著不同的作用。如長崎裸甲藻Gymnodinium nagasakiense赤潮的開始階段，菌群對其生長有促進作用，而赤潮消亡時期，則表現(xiàn)為抑制作用。若在赤潮已形成后的早期投放細菌，勢必投入大量抑藻細菌才可改變菌群組成以達到抑藻目的;若在赤潮后期投放細菌，則不需太多的量，也可比較有效地促進赤潮的消亡。最恰當(dāng)?shù)姆椒ㄊ嵌ㄆ跈z測海洋菌群的組成，如果發(fā)現(xiàn)其多樣性下降(這往往是赤潮的先兆)，立即投放多種抑藻細菌，以維持海洋生態(tài)環(huán)境的生態(tài)平衡，防患于未然。
5.4 海水影響程度。諸多研究表明，細菌的殺藻作用與水環(huán)境營養(yǎng)濃度有密切關(guān)系。有些細菌的殺藻作用是通過與藻類競爭有限的營養(yǎng)物而使藻細胞餓死。這樣的水體中，營養(yǎng)物濃度不會過高。而有些細菌的殺藻作用只有在營養(yǎng)豐富的基質(zhì)中才會發(fā)生，如粘細菌的赤潮(這是較為常見的)，就不能不考慮那里的營養(yǎng)程度是否足以為粘細菌殺藻提供可能，如果營養(yǎng)很貧乏，就不能采用粘細菌來防治這樣的赤潮。
6 細菌防治的可能途徑
6.1 必須分離出對水華及赤潮藻類有特殊抑制效果的菌株。在實驗室檢測其抑藻效果，測量其最低抑藻濃度等有關(guān)指標(biāo)，對每種細菌建立一個檔案，保存起來以備使用。
6.2 細菌或細菌抑藻因子的大量生產(chǎn)。可采用發(fā)酵罐大量繁殖抑藻細菌;也可采用基因工程手段，將細菌中產(chǎn)生抑藻因子的基因引入工程菌如大腸桿菌進行大規(guī)模生產(chǎn)。
6.3 細菌的投放。大量生產(chǎn)的抑藻菌或抑藻物質(zhì)制成水劑或片劑，隨時可根據(jù)需要投放于水體中。若赤潮已發(fā)生，則投入抑藻物質(zhì);若赤潮尚未發(fā)生，則投入抑藻菌以維持海洋菌群的平衡。
水華和赤潮的爆發(fā)是多種因素綜合作用的結(jié)果，經(jīng)驗表明，僅靠一種治理方案往往難以取得理想效果。以菌治藻作為水華和赤潮生物防治的一個新對策，尚需其他治理方案的配合，而且還有許多方面值得考慮和進一步探索。只有在生態(tài)系統(tǒng)良性循環(huán)的基礎(chǔ)上以菌治藻，才是溶藻細菌防治水華和赤潮的最佳選擇。
