微藻保存技術

血紅哈卡藻/紅色裸甲藻 Akashiwo sanguinea

微藻營養(yǎng)豐富,是魚、蝦、貝等經濟動物人工育苗的基礎。特別是海洋微藻,由于富含EPA和DHA,在許多方面受到人們的青睞。在微藻的培養(yǎng)和應用中,保種技術十分重要,它是微藻培養(yǎng)和進一步應用的基礎和關鍵環(huán)節(jié)。由于藻種極易受污染,分離培養(yǎng)方法比較復雜而且耗時較長,因此,在微藻保種工作中要盡量減少接種次數,避免藻種被雜藻、細菌或原生動物污染,既能達到長期貯藏種質的目的,又能維持藻種的活性,是微藻科研工作者努力的方向之一。本文就微藻保存的幾種常用方法介紹如下。

一、繼代法保存

繼代保存法是目前普遍采用的方法,使用于一切藻種的保存。通常在常溫或常低溫進行。常溫一般指15℃~25℃,常低溫一般指0℃~15℃,藻種可接種在固體、液體或雙相培養(yǎng)基中。接種后應首先放在適宜的光照條件下培養(yǎng),待藻細胞生長繁殖達到較高密度,可見明顯的條狀或塊狀的藻細胞群時,再移置低溫、弱光的條件下保藏。保藏半年到1年后必須進行轉接。此方法簡單易行,但是保存時間短,而且繼代頻繁,容易發(fā)生污染和變異。

二、固定化保存法

固定化細胞(1mmobilized cells)是指將游離細胞包埋在多糖或多聚化合物制成的網狀支持物中,固定載體束縛藻種,影響其代謝過程,從而抑制細胞的生長和分裂。固定化微生物技術是在20世紀60年代固定化酶技術的基礎上發(fā)展起來的,1978年以來,固定化技術就被用來作為延長光合細胞壽命的一種重要手段。但微藻存活時間從1個月到幾年不等。張繼紅將三角褐脂藻固定在褐藻酸鈣凝膠中,可保存3~5年;Tamponnet等報道了固定化纖細裸藻存活2年;矮小海鏈藻(Thalassiosira pseudonana)和賀氏鈣板金藻 (Emiliana hux liyi)僅能保存3個月。近來孟妍等人采用褐藻膠包埋技術與干燥脫水技術相結合將綠色巴夫藻常溫保存,保存時間可達6個月存活率高達77.6%。

固定化保種技術對多數微藻是適用的,該法可以在常低溫下實現對藻類的中期保存,培養(yǎng)保存時間較長,活化復蘇快,技術設備簡單,細胞外滲少,而且可用于次生代謝物質的生產。在一般的微藻實驗室內都能進行。但固定化程序較復雜,大多數微藻在培養(yǎng)后期常會從膠珠中溢出。而且,現有的資料表明,某種固定化方法只適用一定種類的微藻,對于其他種類的微藻會有不同的反應,原因復雜,還需要做更深入、廣泛的研究。這就給固定化保種技術的推廣帶來了一定的困難。

三、超低溫保種技術

所謂超低溫保存區(qū)別于其他低溫概念的冰箱溫度(4℃~~40℃)和干冰溫度(~79℃),是指在液氮低溫(~196℃)下保存。此時生物體的物質代謝和生長活動幾乎完全停止??墒撬鼈內蕴幱诳赡娴某苫顮顟B(tài)。早在20世紀70年代,英國的Morris等就對海產單胞藻進行了超低溫保存研究,取得了在~196℃下保存1年,存活率100%的結果。目前普遍采用兩步冷凍法,即慢速降溫進行冷適應,然后投入液氮中保存。王起華等用兩步冷凍法研究了3種餌料金藻,其存活率均在30%左右。

超低溫保存法具有保持種質遺傳穩(wěn)定性、對藻種進行優(yōu)勝劣汰、便于長期保存、能最大限度地減少污染等方面的優(yōu)點,還能省去藻種的活力監(jiān)測和繁殖更新。但微藻的種類很多,生理狀態(tài)各異,適宜的保存條件各不相同,找出不同微藻的超低溫保種方法困難,而且不同的細胞要求不同類型、不同濃度的抗凍劑, 至今還沒有找出1種對所有種類都適用的保護劑。但隨著研究的深入,在探明生物細胞凍害和抗凍機理的基礎上,超低溫保存微藻藻種的應用前景將會是十分光明的。

四、濃縮低溫保存技術

濃縮低溫保存法是將藻液高密度培養(yǎng)后,采用物理、化學的方法濃縮1000倍左右,再低溫保存。國外自80年代末開始就有對海洋經濟微藻的濃縮方法和低溫保存方法進行研究,取得了不少的研究成果,其中美國、英國和日本已有相應的產品(微藻濃縮細胞或稱“藻膏”)問世。蔣霞敏等將小球藻和球等鞭金藻301(1sochrysis galbana Park)濃縮后,在5℃~7℃的冰箱中保存1~3個月后恢復生長獲得好于常溫的效果。孫建華、王如才(1993)對小新月菱形藻(Nitzschia closterium)、球等鞭金藻的濃縮和保存方法進行了研究,濃縮藻液在1℃~4℃的低溫下加保護劑SAMs保存3個月,復蘇后效果良好。
濃縮低溫保存多用于海洋微藻。微藻濃縮液的生產,可以使海洋微藻的生產與使用保留一定的時間差。但相對保存時間較短,海洋微藻的抗逆原理還有待作更多的研究和探討。

五、冷凍真空干燥保存法

冷凍真空干燥保存法是在極低溫度下(~70℃左右)快速冷凍,然后在極低溫度下真空干燥,使藻種的新陳代謝活動處于高度靜止狀態(tài)。19世紀末Fkral與Mudd創(chuàng)立的冷凍真空干燥法是迄今公認最佳的藻種保存法,嚴珍等選擇脫脂牛奶作為保護劑,將藻液放入安瓿管中,冷凍、干燥并抽真空,火焰熔封。在低溫避光處保存,預計最大保存年限為18年。冷凍干燥保存法優(yōu)點是微藻復蘇效果好,保藏期內可避免其他雜菌污染,便于攜帶運輸,易實現商品化生產;其缺點是操作繁瑣、對設備要求高等;應用前景十分光明。

六、低溫甘油生理鹽水法

低溫甘油生理鹽水法是對甘油原液保存法的改進。加入生理鹽水適當降低了甘油的高滲作用,更有利于藻種的保存。在藻液中人一定的甘油作保護劑,同時加入一定的生理鹽水,混勻后直接放置在~20℃±0.5℃冰箱放置保存。保存時間長,一般3年左右。
綜上所述,單細胞藻類的保種技術尚沒有發(fā)展成為一項成熟穩(wěn)定的技術,許多問題還有待于我們去探索,開展微藻保種方面的研究工作,不但會填補微藻保種理論研究上的空白,還會在生產實踐中發(fā)揮應有的作用。

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