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作者：廈門大學(xué) 李峰

在微藻培養(yǎng)過程中，需要了解微藻細(xì)胞的生長情況和速率，這個(gè)時(shí)候最常用的方法就是生長曲線繪制，這個(gè)時(shí)候用血球計(jì)數(shù)板是最常用的計(jì)數(shù)方法。本文作者提供利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算藻細(xì)胞密度數(shù)量的操作步驟和常見問題。

利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)方法

一、血球計(jì)數(shù)版計(jì)數(shù)所需的儀器和試劑

圖1血球計(jì)數(shù)版計(jì)數(shù)所需的儀器和試劑

二、魯格試劑的配制

即將6克碘化鉀溶于20ml水中，待其完全溶解后，加入4克碘充分搖動(dòng)，待碘全部溶解后定容到100ml即配成魯哥氏液。（用棕色玻璃瓶裝）。

固定濃度：每1000毫升水樣加入10-15毫升魯哥氏液。

三、血球計(jì)數(shù)版的基本構(gòu)造：

1、基本結(jié)構(gòu)

血球計(jì)數(shù)版用優(yōu)質(zhì)厚玻璃制成。每塊計(jì)數(shù) 板由H形凹槽分為2個(gè)同樣的計(jì)數(shù)池。計(jì)數(shù)池兩側(cè)各有一支持柱，將特制的專用蓋玻片覆蓋其上，形成高0.1mm的計(jì)數(shù)池，如圖所示：

?????????????????????????圖2 血球計(jì)數(shù)版結(jié)構(gòu)示意圖

2、計(jì)數(shù)區(qū)

計(jì)數(shù)區(qū)的刻度：計(jì)數(shù)區(qū)分成25個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格。計(jì)數(shù)區(qū)邊長為1mm，則計(jì)數(shù)區(qū)的面積為lmm²，每個(gè)小方格的面積為1/400mm²。蓋上蓋玻片后，計(jì)數(shù)區(qū)的高度為0.1mm，所以每個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)的體積為0.1mm³，每個(gè)小方格的體積為1/4000mm³，如圖所示：

圖3 計(jì)數(shù)區(qū)示意圖,紅色區(qū)域?yàn)?6個(gè)1/400的小方格組成

四、計(jì)數(shù)步驟

（1）準(zhǔn)備待測(cè)藻液（如果濃度過高，進(jìn)行稀釋），用Lugol’s solution固定。?

（2）取潔凈的血球計(jì)數(shù)板一塊，在計(jì)數(shù)區(qū)上蓋上一塊蓋玻片。

（3）用移液器吸取少許藻液（20μl），從計(jì)數(shù)板中間平臺(tái)兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣滴入一小滴（如圖4）。

圖4 加樣示意圖

（4）靜置片刻，使細(xì)胞沉降到計(jì)數(shù)板上，不再隨液體漂移。將血球計(jì)數(shù)板放置于顯微鏡的載物臺(tái)上夾穩(wěn)，先在低倍鏡下找到計(jì)數(shù)區(qū)后，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察并計(jì)數(shù)。

（5）在圖5中區(qū)域（25個(gè)中格選5個(gè)區(qū)域）進(jìn)行計(jì)數(shù)。

（6）每個(gè)樣品重復(fù)2-3次。

（7）計(jì)算。

??????計(jì)算公式為：

五、注意事項(xiàng)

為了保證計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性，避免重復(fù)計(jì)數(shù)和漏記，在計(jì)數(shù)時(shí)，對(duì)沉降在格線上的細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)應(yīng)有統(tǒng)一的規(guī)定。如藻細(xì)胞位于大方格的雙線上，計(jì)數(shù)時(shí)則數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線，以減少誤差。即位于本格上線和左線上的細(xì)胞計(jì)入本格，本格的下線和右線上的細(xì)胞不計(jì)入本格。見圖6：

六、使用技巧

血球計(jì)數(shù)板在使用中可以用到如下技巧：

1. 為了計(jì)數(shù)視野清晰，其實(shí)可以往水里加點(diǎn)染料，或者加個(gè)濾光片，顯微鏡下看反差會(huì)大些，用投射光源不要反射光
2. 一般計(jì)數(shù)的取樣在幾微升，要用移液槍
3. 細(xì)胞計(jì)數(shù)板在使用一段時(shí)間后，顯微鏡下看不清格子，記得每次使用完用稀鹽酸或者酒精清洗。